服務介紹
Nanopore直接RNA測序技術是對天然RNA進行測序，是對單個RNA分子進行單分子水平的全長測序，能夠保留并檢測RNA堿基修飾信息，對poly(A)尾長進行相對準確的估算，同時進行全長異構體分析，還原真實RNA特征。
Nanopore Direct RNA測序流程圖（2019 Workman et al）
測序方案
測序模式：Nanopore Sequencing
測序數據量：6Gb/樣，or 10Gb/樣，or 15Gb/樣
技術優勢
1、Direct RNA技術無需PCR，無GC偏好性提供無偏全長且鏈特異的RNA序列；
2、Direct RNA技術準確檢測poly(A)尾長度為分析RNA穩定性和翻譯效率等轉錄后調控研究提供幫助；
3、Direct RNA技術直接識別RNA堿基修飾信號實現轉錄和表觀信息的一舉多得。
利用Nanopore測序技術對人類poly(A)轉錄組進行直接RNA測序
高通量cDNA測序使我們對轉錄組的復雜性和調控有了更深入的了解，但是該方法不能完全展現轉錄組的真實信息，其測序讀長較短并且去除了天然RNA的堿基修飾信息。本研究利用Nanopore直接RNA測序技術從人類B淋巴細胞系GM12878分離并測序了原始poly(A) RNA，共生成約990萬條通過質控的poly(A) RNA序列，讀長N50約1,334bp。利用以上長讀長數據，研究者首先檢測和分析了轉錄異構體，在代表10,793個基因的33,984個異構體中，發現52.6%未經注釋的剪接連接點，識別出了上千個目前在GENCODE v27中未經注釋的基因，并發現了使用短讀長測序則無法檢測到的等位基因特異性異構體。例如：IFIH1基因，其父系同型保留了8號外顯子，而母系同型則不保留8號外顯子（圖1）。
圖1 ONT直接RNA測序轉錄本識別FIH1的等位基因特異性異構體的IGV視圖。紫色方框指示等位基因特異性的SNP的位置（灰色為參考，紅色和藍色為SNPs），綠色方框指示可變剪接外顯子。
隨后結合短讀長數據，研究團隊直接測量了poly(A)尾長，分析發現了異構體間poly(A)尾的區別。采用ONT直接RNA測序對RNA結合蛋白DEAD-box解旋酶5（DDX5）的轉錄本poly(A)尾長度進行估計，內含子保留異構體的poly(A)尾長中值為327nt，而其蛋白編碼異構體的poly(A)尾長中值為125nt（圖2）。
圖2 DDX5基因兩種轉錄本異構體的poly(A)尾長分布及基因模型
最后，利用直接RNA測序數據中包含的RNA修飾信息，研究人員篩選了GENCODE敏感亞型的離子電流在GGACU模體(motif)上的改變，發現了86個基因(198個異構體) 的電流變化可以歸因于異構體特異性m6A修飾。
圖3 SNHG8基因異構體內GGACU motif的離子電流分布
研究人員表示基于短讀長測序的RNA修飾分析去除了修飾之間以及修飾與其他RNA之間的特征，而Nanopore直接RNA測序則具備檢測這些遠程互作的能力。
參考文獻
Workman R E, Tang A D, Tang P S, et al. Nanopore native RNA sequencing of a human poly (A) transcriptome[J]. Nature methods, 2019: 1-9.
生信分析
isoform分析
可變剪切分析
融合基因鑒定
PolyA分析
表達定量
轉錄本定量
轉錄本差異分析
富集分析
蛋白質互作網絡
甲基化修飾分析
m6A位點注釋
甲基化修飾富集分析
m6A差異分析
isoform聯合定量表達分析
AltTP分析
功能多樣性分析（FDA）
差異富集分析
新生mRNA分析
識別新生mRNA
新生mRNA半衰期分析
mRNA穩定相關性分析
新生mRNA差異分析
Table. Nanopore Direct RNA Sequencing樣本送樣建議
送樣類型 | 送樣量 | 完整性（RIN值） | 濃度 | 純度 |
Total RNA（組織、細胞、全血等） | ≥50μg | ≥8 | ≥180ng/μL | 無DNA，蛋白/鹽離子等污染，樣本無色透明不粘稠 |
RNA帶poly(A)尾 | ≥300ng | - | ≥50ng/μL | 無DNA，蛋白/鹽離子等污染，樣本無色透明不粘稠 |
*更具體的送樣方法請詳詢銷售或技術支持
物種范圍
人、小鼠、大鼠等哺乳動物，植物等其他物種詳詢銷售或技術支持
