服務(wù)介紹
RNA pull-down是檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)手段之一。RNA pull-down標(biāo)簽法原理：將RNA標(biāo)簽（可產(chǎn)生特殊結(jié)構(gòu)，與捕獲蛋白結(jié)合）引入circRNA中，通過捕獲蛋白結(jié)合circRNA上的標(biāo)簽 ，實(shí)現(xiàn)捕獲蛋白/circRNA/RBPs/miRNA復(fù)合物產(chǎn)生；再通過捕獲蛋白抗體下拉復(fù)合物，對(duì)捕獲產(chǎn)物檢測(cè)，鑒定出可能與circRNA相互作用的蛋白或者RNA。
pull-down標(biāo)簽法技術(shù)原理（以circRNA為例）
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1. 通過基因過表達(dá)載體引入外源標(biāo)簽，標(biāo)簽與捕獲蛋白間的相互作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于探針分子的捕獲作用，特異性更高；
2. 標(biāo)簽的插入位置可靈活設(shè)計(jì)；
3. 不依賴于細(xì)胞內(nèi)基因本底表達(dá)量，對(duì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)豐度低的基因同樣適用。
客戶提供
1. 基因名稱（ID）、長(zhǎng)度、序列、物種；
2. 指定載體名稱；
3. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>
4. 預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)信息；
5. 細(xì)胞和細(xì)胞相關(guān)信息。
我們提供
1. 詳細(xì)的circRNA pull-down完整實(shí)驗(yàn)報(bào)告（包含載體構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)、pull-down富集等）；
2. 帶標(biāo)簽過表達(dá)質(zhì)粒、不帶標(biāo)簽過表達(dá)質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒（贈(zèng)送）等；
3. 額外贈(zèng)送（以下情況任選一）：質(zhì)譜檢測(cè)2個(gè)樣本；pulldown產(chǎn)物3個(gè)以內(nèi)miRNA qPCR檢測(cè)。
circRNA pull-down實(shí)驗(yàn)分組
案例1
參考文獻(xiàn)：
Chen Z, Li Y, He K, Yang J, Deng Q, Chen Y, Fu Z. CircGPRC5A enhances colorectal cancer progress by stabilizing PPP1CA and inducing YAP dephosphorylation. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Dec 6;42(1):334. doi: 10.1186/s13046-023-02915-7. PMID: 38057879; PMCID: PMC10698990.
案例2
參考文獻(xiàn)：
Yuan Y, Zhang X, Du K, Zhu X, Chang S, Chen Y, Xu Y, Sun J, Luo X, Deng S, Qin Y, Feng X, Wei Y, Fan X, Liu Z, Zheng B, Ashktorab H, Smoot D, Li S, Xie X, Jin Z, Peng Y. Circ_CEA promotes the interaction between the p53 and cyclin-dependent kinases 1 as a scaffold to inhibit the apoptosis of gastric cancer. Cell Death Dis. 2022 Sep 27;13(9):827. doi: 10.1038/s41419-022-05254-1. PMID: 36167685; PMCID: PMC9515085.
通過pull-down實(shí)驗(yàn)將MS2-CP-MS2-circRNA復(fù)合物拉下來，WB檢測(cè)MS2-CP蛋白，RT-qPCR檢測(cè)目的circRNA的富集程度。
pull-down樣品分組
分組 | pull-down抗體 | Input 樣品 | 樣品編號(hào) | 描述 |
pull-down組 | anti-flag | CAAAAA-MS2+MS2-CP | 5 | 目的circRNA富集產(chǎn)物組 |
CAAAAA+MS2-CP | 6 | 無捕獲標(biāo)簽對(duì)照產(chǎn)物組 | ||
CAAAAA-MS2+NC | 7 | 無捕獲蛋白對(duì)照產(chǎn)物組 | ||
CAAAAA+NC | 8 | 無捕獲標(biāo)簽、蛋白對(duì)照產(chǎn)物組 | ||
IgG | CAAAAA-MS2+MS2-CP | IgG | 陰性對(duì)照組 |
WB檢測(cè)結(jié)果
圖1 pull-down 前后樣本W(wǎng)B檢測(cè)結(jié)果（Flag抗體）
（1~8組分別對(duì)應(yīng)pull-down實(shí)驗(yàn)分組樣品編號(hào)）
RT-qPCR驗(yàn)證pull-down富集效果
qPCR產(chǎn)物檢測(cè)hsa_circ_00AAAAA富集倍數(shù)
Sample name | hsa_circ_00AAAAA Average CT (Input) | hsa_circ_00AAAAA Average CT (pull-down) | 2-ΔΔCT1 | 2-ΔΔCT2 | 2-ΔΔCT3 | Average 2-ΔΔCT±SD | SEM |
6 | 21.7±0 | 24.5±0 | 1 | 1 | 1 | 1±0 | 0 |
7 | 21.4±0 | 23.89±0 | 1.24 | 1.24 | 1.24 | 1.24±0 | 0 |
8 | 22.19±0 | 24.85±0 | 1.1 | 1.1 | 1.1 | 1.1±0 | 0 |
IgG | 23.3±0 | 25.19±0 | 1.88 | 1.88 | 1.88 | 1.88±0 | 0 |
5 | 23.3±0 | 18.62±0 | 178.53 | 178.53 | 178.53 | 178.53±0 | 0 |
圖2 pull-down產(chǎn)物檢測(cè)hsa_circ_00AAAAA富集倍數(shù)
（1~8組分別對(duì)應(yīng)pull-down實(shí)驗(yàn)分組樣品編號(hào)）
