以上問題均可從RNA翻譯的角度切入深究，我們之前已經介紹過各種翻譯組分析技術，錯過的朋友可以回頭看看↓↓

推薦閱讀：收藏！翻譯組研究技術全覽：Polysome/Ribo/RNC/Disome-seq

其中Polysome profiling被廣泛應用于翻譯研究。歷久彌新的Polysome profiling還被稱為翻譯研究傳統的“金標準”。^[1]

翻譯過程中，核糖體小亞基（40s）首先與mRNA的5’端結合，并沿5’→3’方向掃描mRNA，直到識別起始密碼子。隨后，60s核糖體大亞基在這個位置與40s亞基結合，形成具有催化活性的80s核糖體，進而啟動肽鏈延伸及蛋白合成。由于多個核糖體可以同時結合同一條mRNA，因此mRNA上結合的核糖體數量可間接反映翻譯活性。相比之下，僅結合單核糖體的RNA通常翻譯水平較低或處于翻譯停滯狀態，而僅結合核糖體亞基的RNA可能尚未啟動翻譯。

Polysome profiling技術建立于20世紀60年代，根據核糖體結合RNA的翻譯特性，結合越多核糖體的RNA沉降系數越大，基于蔗糖梯度超離心，可將細胞質RNA分離成無結合核糖體RNA（游離RNA）、結合40s和60s核糖體亞基、單核糖體（80s）和不同數量多聚核糖體等多個組分。通過分析RNA或蛋白質在不同組分的分布情況，可評估翻譯狀態，研究翻譯調控機制。

Polysome profiling技術路線圖。^[1]

①裂解細胞：添加翻譯延伸抑制劑，在增殖階段裂解細胞，分離細胞質裂解液；

②超速離心：把裂解液轉移到梯度蔗糖溶液后，超速離心將RNA分離成不同的組分；

③收集組分：利用密度梯度分餾系統，UV吸光度檢測核酸濃度并收集各個組分；

④回收產物：從蔗糖溶液組分中回收RNA復合物；

⑤分析產物：繪制核糖體圖譜；RT-qPCR分析特定RNA；高通量測序分析全局RNA概況；Western Blot或質譜分析蛋白質。

①高分辨率

Polysome profiling通過分離結合不同數量核糖體的RNA，可區分不同翻譯活性的RNA，準確計算RNA的翻譯效率（TE）。

通過Polysome profiling計算TE。^[2]

此外，Polysome profiling可作為Disome-seq等技術的預檢測環節，查看圖譜特定的峰，判斷樣本質量及是否適合下游檢測。

Polysome profiling中呈現雙核糖體峰。^[3]

② 動態監測

Polysome profiling體現RNA在各組分的分布變化，可捕捉藥物處理、應激、病理等條件下的翻譯活性的動態變化。

Polysome profiling分析EDTA處理和未處理的RNA翻譯狀態，同時研究翻譯調控蛋白的分布。^[4]

③ 高兼容性

Polysome profiling下游產物可進行多種檢測：高通量測序分析全局翻譯狀態；RT-qPCR驗證不同條件下特定基因的翻譯狀態；WB/質譜同步驗證翻譯活性，還可分析翻譯調控因子。

④ 高靈活性

Polysome-seq可挖掘潛在翻譯的ncRNA，并結合Polysome-qPCR驗證翻譯活性。從數據庫或軟件中預測到的潛在翻譯ncRNA，也可以利用Polysome profiling+qPCR驗證可翻譯性，干濕實驗結合，性價比更高！

推薦閱讀：如何研究讓腫瘤又愛又恨的“ncRNA”編碼肽？

Polysome profiling驗證膠質細胞瘤中circ-SMO的可翻譯性。^[5]

?

Polysome profiling難嗎？不就是蔗糖溶液密度梯度離心嗎？

對，但不全對！

① 需要專業設備：Polysome profiling需要用大型超速離心機，離心數小時以保證多個組分的清晰分離；隨后的組分檢測和收集也需專用的密度梯度分餾系統，包括流量控制的泵以及UV檢測器。

② 操作較繁瑣：需一系列繁瑣的溶液配置、離心、分離、檢測等操作步驟，耗時長且對操作者要求較高。

③ 容易受干擾：細胞內普遍存在高分子量的復合物，容易對多聚核糖體收集和檢測造成干擾。

①準備足夠的樣本

每個樣本細胞量需≥ 1×10⁷，且確保不同組別的樣本細胞量一致。

②做好樣本前處理

支原體檢測：收集細胞樣本（特別是用于測序的樣本）做支原體檢測，確保無支原體感染；

固定翻譯狀態：收集細胞前，細胞培養基中加入放線菌酮（cycloheximide），細菌樣本需加入氯霉素（chloramphenicol）抑制翻譯延伸；

收集細胞：對于貼壁細胞建議用胰酶消化，盡量避免用刮刀刮下細胞，而胰酶中也需加入放線菌酮。

私信公眾號后臺，發送“polysome”，可獲取詳細的Polysome profiling樣本前處理詳細步驟 。

③專業檢測

一般實驗室較少配備大型超速離心機，因此送專業的機構檢測既可解決設備問題，又可解決繁瑣且高難度的操作問題。

④合理選擇組分

產物測序分析：用于評估全局翻譯活性、篩選受翻譯調控基因、篩選可翻譯基因等。測序所需樣本較多，成本較高。因此可以適當合并組分，一般選擇一對組分用于對比，如結合多聚核糖體組分（P）vs 無結合多聚核糖體組分（NP）、結合多聚核糖體組分（P）vs無結合核糖體組分（ribosome-free）或結合多聚核糖體組分（P）vs總RNA等。

產物qPCR/WB檢測：用于驗證階段，為準確評估RNA在各組分的分布變化，應盡量細分組分，獲取足夠的數據點，更準確地呈現特定RNA的翻譯活性變化。

助力攻克各種翻譯研究難題

①根據沉降系數大小，提供沉降系數從小到大共18個分離的組分，可增加RT-qPCR數據點，繪制更詳細的翻譯動態折線圖，更精準反映翻譯活性的動態變化；

②增加RNA質控，檢測RNA完整性，確保下游的分析:

如送樣不均衡，可根據質檢結果進行相對等量上機(但不一定準，因為復合物含核酸和核糖體、蛋白等)

③能處理的樣本類型增多：包括細胞、組織、細菌、真菌菌體等。

④統計AUC值(P/non-P ratio常用于表征樣品整體的翻譯活性)

例：

參考資料

[1] Su D, et al. Ribosome profiling: a powerful tool in oncological research. Biomark Res. 2024, 12(1):11.

[2] Kovalski JR, et al. Functional screen identifies RBM42 as a mediator of oncogenic mRNA translation specificity. Nat Cell Biol. 2025 Mar;27(3):518-529.

[3] Zhao T, et al. Disome-seq reveals widespread ribosome collisions that promote cotranslational protein folding. Genome Biol. 2021 Jan 5;22(1):16.

[4] Kovalski JR, et al. Functional screen identifies RBM42 as a mediator of oncogenic mRNA translation specificity. Nat Cell Biol. 2025 Mar;27(3):518-529.

[5] Wu X, et al. A novel protein encoded by circular SMO RNA is essential for Hedgehog signaling activation and glioblastoma tumorigenicity. Genome Biol. 2021;22(1):33.