RNA pull-down是檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白與RNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)手段之一。該技術(shù)利用體外合成生物素標(biāo)記RNA模擬天然RNA分子，作為探針，與細(xì)胞裂解液孵育。探針與裂解液中的蛋白形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，可被鏈霉親和素磁珠特異性結(jié)合捕獲，從而實(shí)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白（RBPs）的捕獲富集。

產(chǎn)品特點(diǎn)

1. 方便：試劑盒成分完整，包含pull-down實(shí)驗(yàn)整套試劑；

2. 快捷：2.5小時(shí)即可完成；

3. 穩(wěn)定：捕獲效率高，實(shí)驗(yàn)體系穩(wěn)定，重復(fù)性高。

產(chǎn)品應(yīng)用

● 靶RNA結(jié)合蛋白的驗(yàn)證或篩選；

● 適用長(zhǎng)鏈、線性 RNA 探針（模擬靶 RNA 序列）直接拉取互作蛋白。

操作流程

結(jié)果展示

圖1. AR+探針特異性捕獲HuR蛋白

RNA pulldown 實(shí)驗(yàn)就是先將RNA進(jìn)行生物素標(biāo)記，再與細(xì)胞裂解液共同孵育，從而形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，之后再分離復(fù)合物得到蛋白質(zhì)，通過(guò)WB或質(zhì)譜檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)。

我們知道，RIP是從蛋白出發(fā)研究蛋白R(shí)NA相互作用的技術(shù)，通過(guò)已知蛋白去驗(yàn)證可能有相互作用RNA分子；而RNA pull-down則是從RNA出發(fā)研究蛋白與RNA相互作用的技術(shù)，通過(guò)已知RNA去拉蛋白，推測(cè)可能與已知RNA結(jié)合的蛋白分子。所以RIP和RNA pull-down兩種技術(shù)可以從正反雙向進(jìn)行驗(yàn)證，能更準(zhǔn)確的反映RNA與蛋白的相互作用。

案例1

胃癌是全球第四大診斷類(lèi)癌癥，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大常見(jiàn)原因。由于胃癌進(jìn)展的病理機(jī)制尚不完全清楚，因此需要更多的研究來(lái)發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)胃癌診斷和治療的有效生物標(biāo)志物和靶標(biāo)。在本文中，作者發(fā)現(xiàn)并命名了一種新的lncRNA_GClnc1。它作為支架(Scaffold) lncRNA募集WDR5和KAT2A這兩種蛋白質(zhì)，并激活靶基因SOD2的轉(zhuǎn)錄，最終促進(jìn)胃癌進(jìn)展。

圖1. GClnc1 RNA pull-down結(jié)果圖

本文研究中，為了探索GClnc1促進(jìn)胃癌的機(jī)制，作者使用了RNA pull-down分析來(lái)鑒定細(xì)胞內(nèi)GClnc1結(jié)合因子（Fig-1A）。 GClnc1下拉樣本中有兩個(gè)特定的條帶。作者鑒定了94和101種潛在的結(jié)合蛋白（Fig-1B）。Western印跡顯示僅WDR5和KAT2A特異性結(jié)合GClnc1（Fig-1C）。數(shù)據(jù)表明這兩種蛋白質(zhì)可能形成復(fù)合物以與GClnc1相互作用。[1]

案例2

(A) 通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成生物素標(biāo)記的有義和反義 (陰性對(duì)照) MEG3 RNA。(B)體外RNA 下拉試驗(yàn)。HEK293T 細(xì)胞裂解物與生物素標(biāo)記的寡核苷酸一起孵育。下拉后，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行 SDS-PAGE 并用考馬斯亮藍(lán)染色。對(duì)箭頭指示的條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析。(C) 蛋白質(zhì)印跡以確定有義MEG3 RNA 與 PTBP1 蛋白的特異性相互作用，但不與 PCNA 蛋白（陰性對(duì)照）。(D) PTBP1 與MEG3 RNA在體內(nèi)相互作用的 RNA 免疫沉淀 (RIP)在 HEK293T 細(xì)胞中。使用 MEG3 或 Hprt1 的特異性引物（陰性對(duì)照）通過(guò) RT-PCR 測(cè)定由抗 PTBP1 或 IgG 免疫沉淀的蛋白質(zhì)-RNA 復(fù)合物。

該研究中，首先通過(guò)RNA Pulldown和后續(xù)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)找到了與lncRNA MEG3結(jié)合的蛋白PTBP1，然后再通過(guò)PTBP1的抗體的RIP實(shí)驗(yàn)反向驗(yàn)證了lncRNA MEG3與PTBP1蛋白的結(jié)合。

案例解析參考文獻(xiàn)：

[1] Tian-Tian Sun, Jie He, Qian Liang, Lin-Lin Ren, Ting-Ting Yan, Ta-Chung Yu, Jia-Yin Tang, Yu-Jie Bao, Ye Hu, Yanwei Lin, Danfeng Sun, Ying-Xuan Chen, Jie Hong, Haoyan Chen, Weiping Zou and Jing-Yuan Fang. LncRNA GClnc1 Promotes Gastric Carcinogenesis and May Act as a Modular Scaffold of WDR5 and KAT2A Complexes to Specify the Histone Modification Pattern. Cancer Dis. July 2016

[2] Long noncoding RNA MEG3 induces cholestatic liver injury by interaction withPTBP1 to facilitate shp mRNA decay.Hepatology 2017 02;65(2)

[1] IF8.469 Linc-ROR facilitates progression and angiogenesis of hepatocellular carcinoma by modulating DEPDC1 expression. Cell Death & Disease

[2] IF6.684 Inhibition of miR-185-3p Confers Erlotinib Resistance Through Upregulation of PFKL/MET in Lung Cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology

[3] IF6.244 circDNMT1 Promotes Malignant Progression of Gastric Cancer Through Targeting miR-576-3p/Hypoxia Inducible Factor-1 Alpha Axis. Frontiers in Oncology

[4] IF5.555 Long Noncoding RNA X-Inactive-Specific Transcript Promotes the Secretion of Inflammatory Cytokines in LPS Stimulated Astrocyte Cell Via Sponging miR-29c-3p and Regulating Nuclear Factor of Activated T cell 5 Expression. Frontiers in Endocrinology

[5] IF5.502 Silencing of LINC01963 enhances the chemosensitivity of prostate cancer cells to docetaxel by targeting the miR-216b-5p/TrkB axis. LABORATORY INVESTIGATION

[6] IF5.458 Increased LDL receptor by SREBP2 or SREBP2-induced lncRNA LDLR-AS promotes triglyceride accumulation in fish. iScience

[7] IF5.241 The lncRNA MIAT regulates CPT-1a mediated cardiac hypertrophy through m6A RNA methylation reading protein Ythdf2. Cell Death Discovery

[8] IF5.228 C/EBPα promotes porcine pre-adipocyte proliferation and differentiation via mediating MSTRG.12568.2/FOXO3 trans-activation for STYX. BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-MOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF LIPIDS

[9] IF4.599 CircDTL Functions as an Oncogene and Regulates Both Apoptosis and Ferroptosis in Non-small Cell Lung Cancer Cells. Frontiers in Genetics

[10] IF4.36 Circ_0001667 knockdown blocks cancer progression and attenuates adriamycin resistance by depleting NCOA3 via releasing miR-4458 in breast cancer. DRUG DEVELOPMENT RESEARCH

[11] IF3.575 Knockdown of circBFAR inhibits proliferation and glycolysis in gastric cancer by sponging miR-513a-3p/hexokinase 2 axis. BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS

[12] IF2.952 Circular RNA OMA1 regulates the progression of breast cancer via modulation of the miR?1276/SIRT4 axis. Molecular Medicine Reports

[13] IF2.626 Regulation of circADAMTS6-miR-324-5p-PIK3R3 ceRNA pathway may be a novel mechanism of IL-1β-induced osteoarthritic chondrocytes. JOURNAL OF BONE AND MINERAL METABOLISM

[14] IF2.57 Long Non-Coding RNA GABPB1-AS1 Augments Malignancy of Glioma Cells by Sequestering MicroRNA-330 and Reinforcing the ZNF367/Cell Cycle Signaling Pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment

[15] IF2.192 Silencing of Circ_0135889 Restrains Proliferation and Tumorigenicity of Human Neuroblastoma Cells. JOURNAL OF SURGICAL RESEARCH

1、 這個(gè)pulldown試劑盒能做circRNA嗎？

目前公司的RNA-Protein pulldown試劑盒適用于線性RNA，circRNA可以了解標(biāo)簽法，公眾號(hào)解讀“新一代circRNA pulldown 研究方法”有詳細(xì)的介紹。

2、 pulldown產(chǎn)物是否能檢測(cè)互作的RNA？用Trizol是否能抽提到RNA?

試劑盒體系中目前產(chǎn)物的分離體系主要是蛋白質(zhì)，不涉及RNA提取及檢測(cè)。

3、 目的探針是正義鏈探針還是反義鏈？

目的探針是正義鏈探針，陰性對(duì)照是其反義鏈。

4、 探針的建議用量是多少？

探針的使用量推薦50pmol/次，或根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況調(diào)整用量。

5、 關(guān)于生物素標(biāo)記探針

該試劑盒應(yīng)用的生物素標(biāo)記RNA探針，目的是模擬天然的RNA分子，理論上覆蓋的序列越全越好，可通過(guò)直接合成或體外轉(zhuǎn)錄方式獲取。但序列過(guò)長(zhǎng)（大于2kb）則不易獲得，可優(yōu)先選擇有預(yù)期蛋白結(jié)合的區(qū)域。

6、 怎么判斷實(shí)驗(yàn)操作有沒(méi)有問(wèn)題？

建議在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，試劑盒中是包含陽(yáng)性對(duì)照探針和HuR抗體的；HuR蛋白幾乎存在所有細(xì)胞樣本中，且能夠被陽(yáng)性探針拉下，結(jié)合力較強(qiáng)。可以通過(guò)陽(yáng)性對(duì)照HuR的WB結(jié)果判斷實(shí)驗(yàn)操作是否有問(wèn)題，陰性對(duì)照可選擇性進(jìn)行。

7、 pull down試劑盒中的loading buffer顏色很淡，和平時(shí)用的不一樣，是否正常？

我司pulldown試劑盒的loading buffer 確實(shí)偏淡一些。主要考慮loading buffer過(guò)多會(huì)對(duì)核酸的跑膠結(jié)果有一定影響，因此能看到條帶顯示就足夠了。

8、 RAP（RNA 反義純化）與RNA-protein pulldown有哪些異同？

相同點(diǎn)：都是探針拉取RNA結(jié)合復(fù)合物。

不同點(diǎn)：

1）RAP本質(zhì)是反義探針拉取靶基因及其結(jié)合其上的RNA、蛋白甚至DNA等復(fù)合物。而RNA-protein pulldown是靶基因正義序列探針釣取結(jié)合蛋白。

2）2）RAP本質(zhì)是反義探針與靶基因RNA的核酸雜交，類(lèi)似FISH，反應(yīng)溫度基本在37℃。而RNA-protein pulldown本質(zhì)是長(zhǎng)鏈核酸探針與蛋白之間的結(jié)合互作，反應(yīng)溫度在4℃。