RNA Immunoprecipitation （RIP）是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體，把目的蛋白以及與之結(jié)合的RNA沉淀下來，經(jīng)過分離純化就可以對(duì)復(fù)合物中的RNA進(jìn)行 Microarray（RIP-chip），定量qPCR或高通量測序（RIP-Seq）檢測分析。本試劑包含RIP實(shí)驗(yàn)所需的全套試劑，以及RIP產(chǎn)物的提取試劑，讓實(shí)驗(yàn)更加輕松快捷。
RIP技術(shù)原理圖
產(chǎn)品特點(diǎn)
1.方便快捷：試劑盒成分完整，包含RIP和提取整套試劑，5小時(shí)即可完成。
2.體系穩(wěn)定：捕獲效率高，實(shí)驗(yàn)體系穩(wěn)定，重復(fù)性高。
應(yīng)用范圍
1.與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA及其他相互作用蛋白分析；
2.RBP結(jié)合RNA motif鑒定；
3.不適用膜結(jié)合蛋白、DNA結(jié)合蛋白（組蛋白、核仁蛋白等）的RIP實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)流程
RIP實(shí)驗(yàn)的目的是分析與目的蛋白結(jié)合的RNA，原理則是運(yùn)用針對(duì)目的蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，經(jīng)過分離純化并對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行測序或PCR分析。
2016年9月23日，意大利Maria R. Matarazzo教授在Methods in Molecular Biology雜志介紹了RIP實(shí)驗(yàn)的經(jīng)典操作方法。文中介紹的RIP實(shí)驗(yàn)操作流程如下圖所示：
圖1. 經(jīng)典RIP實(shí)驗(yàn)操作流程（來自[1]）
而RIP實(shí)驗(yàn)有哪些應(yīng)用呢？大家都知道RNA是一種不穩(wěn)定的生物大分子，絕大多數(shù)RNA都需要與特定的RNA結(jié)合蛋白形成RNA-蛋白復(fù)合物才能穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。RNA-蛋白復(fù)合物驅(qū)動(dòng)了幾乎所有細(xì)胞過程的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，包括剪接（splicing）、出核轉(zhuǎn)運(yùn)（nuclear export）、mRNA穩(wěn)定性以及蛋白轉(zhuǎn)譯過程。因此，對(duì)基因調(diào)控的了解就有賴于確定這些過程中RNA的結(jié)合的變化，RIP技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，可應(yīng)用于研究miRNA調(diào)節(jié)靶點(diǎn)、RNA與RNP（RNA結(jié)合蛋白）的互作關(guān)系等。
案例1
RIP用于研究circRNA與蛋白互作
2022年3月29號(hào)，重慶醫(yī)科大學(xué)的陳俊霞教授在Mol Cancer發(fā)表文章Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10，本研究揭示了一種新的機(jī)制，即缺氧誘導(dǎo)的circWSB1可以與USP10相互作用，從而減弱USP10介導(dǎo)的p53穩(wěn)定并促進(jìn)BC的進(jìn)展，為BC提供了一種替代的預(yù)后生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。
圖2
已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA通過miRNA海綿機(jī)制參與缺氧的調(diào)控。幾乎所有這些與缺氧相關(guān)的circRNA都起到了miRNA海綿的作用，環(huán)狀RNA同樣可以通過結(jié)合蛋白以及翻譯多肽發(fā)揮功能。作者使用pull-down對(duì)環(huán)狀RNA的結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行分析，雖然沒有發(fā)現(xiàn)P53，但是作者發(fā)現(xiàn)泛素化酶USP10與circWBS1相互結(jié)合。使用數(shù)據(jù)庫對(duì)二者的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測。設(shè)計(jì)USP10的全長和缺失突變體并插入Flag標(biāo)簽（圖3），通過RIP實(shí)驗(yàn)（使用吉賽生物RIP試劑盒）對(duì)USP10與circWBS1的結(jié)合進(jìn)行了驗(yàn)證。
圖3
案例2
RIP用于研究lncRNA與蛋白互作
圖4. lncRNA和編碼RNA與EZH2結(jié)合能力的比較（來自[3]）
在本研究中，使用EZH2特異性抗體對(duì)人胃癌細(xì)胞系MKN45和AGS，以及對(duì)照細(xì)胞系GES-1進(jìn)行RIP-seq，分析了8256個(gè)與EZH2相關(guān)的RNAs，包括編碼和非編碼RNAs，其中MALAT1在MKN45細(xì)胞系中高表達(dá)。并且發(fā)現(xiàn)MALAT1通過和EZH2相互作用，抑制原鈣黏蛋白因子10（PCDH10）的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。
案例3
RIP用于研究miRNA與蛋白互作
圖5. 缺鐵性和非缺血性NPCs中isomiRs分析（來自[4]）
在本研究中，利用Ago2 RIP-seq，分析非缺血性和缺血性成年大鼠側(cè)腦室下區(qū)（SVZ）的神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）miRNAs的表達(dá)情況[4]。
結(jié)果顯示，相較于非缺血性NPCs，中風(fēng)改變了NPCs中Ago2相關(guān)的miRNAs表達(dá)，缺血性NPCs中的isomiRsreads數(shù)增加，其中5'末端添加核苷酸的isomiR-142-5p_L+2R-1顯著上調(diào)，5'末端缺失核苷酸的isomiR-187-5p_L-2R+3顯著下調(diào)[4]。
案例解析參考文獻(xiàn)
[1] RIP: RNA Immunoprecipitation.Methods Mol Biol, 2016. 1480: p. 73-86.
[2] Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10[J]. Molecular Cancer, 2022, 21(1):1-20.
[3] MALAT1 long ncRNA promotes gastric cancer metastasis by suppressing PCDH10.Oncotarget. 2016 Mar 15; 7(11): 12693–12703.
[4] Identification of miRNomes associated with adult neurogenesis after stroke using Argonaute 2-based RNA sequencing.RNA Biol. 2017; 14(5): 488–499.
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[2] IF17.388 N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg effect: implication in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology
[3] IF14.919 The genomic landscape of cholangiocarcinoma reveals the disruption of post-transcriptional modifiers. Nature Communications
[4] IF11.161 A novel lncRNA ARST represses glioma progression by inhibiting ALDOA-mediated actin cytoskeleton integrity. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH
[5] IF9.261 Mettl14 mediates the inflammatory response of macrophages in atherosclerosis through the NF-κB/IL-6 signaling pathway. CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES
[6] IF8.886 ac4C acetylation of RUNX2 catalyzed by NAT10 spurs osteogenesis of BMSCs and prevents ovariectomy-induced bone loss. Molecular Therapy-Nucleic Acids
[7] IF8.718 The m6A reader IGF2BP3 promotes acute myeloid leukemia progression by enhancing RCC2 stability. EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE
[8] IF8.679 IGF2BP2-dependent activation of ERBB2 signaling contributes to acquired resistance to tyrosine kinase inhibitor in differentiation therapy of radioiodine-refractory papillary thyroid cancer. CANCER LETTERS
[9] IF8.469 A novel 3’tRNA-derived fragment tRF-Val promotes proliferation and inhibits apoptosis by targeting EEF1A1 in gastric cancer. Cell Death & Disease
[10] IF8.469 SF3B4 promotes ovarian cancer progression by regulating alternative splicing of RAD52. Cell Death & Disease
[11] IF8.469 Linc-ROR facilitates progression and angiogenesis of hepatocellular carcinoma by modulating DEPDC1 expression. Cell Death & Disease
[12] IF8.469 A new candidate oncogenic lncRNA derived from pseudogene WFDC21P promotes tumor progression in gastric cancer. Cell Death & Disease
[13] IF8.469 HNRNPA1-mediated exosomal sorting of miR-483-5p out of renal tubular epithelial cells promotes the progression of diabetic nephropathy-induced renal interstitial fibrosis. Cell Death & Disease
1. 可以做膜蛋白或核蛋白的RIP嗎？
為了不影響內(nèi)源蛋白與RNA的互作，RIP裂解液裂解作用較溫和。已有實(shí)驗(yàn)實(shí)例證明，RIP裂解液可以裂解開胞膜及核膜，釋放胞內(nèi)及核內(nèi)蛋白，但與DNA及細(xì)胞膜緊密結(jié)合的蛋白無法裂解釋放出來，因此不適用于DNA與膜結(jié)合的蛋白R(shí)IP。
2. 為什么RIP試劑盒提出來的RNA濃度很低，正常嗎？
RIP產(chǎn)物量一般都不足以直接測量出濃度，可通過定量RT-PCR（如果已知RBP的結(jié)合靶基因），或通過測序技術(shù)進(jìn)行分析。
做qPCR分析時(shí)，由于RNA濃度未知，可取所用反轉(zhuǎn)錄體系的最大上樣量進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。測序時(shí)，如一次實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物量不夠建庫，可重復(fù)實(shí)驗(yàn)，合并產(chǎn)物，也可適當(dāng)提高初始樣本量。
3. 試劑盒RIP RNA產(chǎn)物分析是定量還是半定量式分析？
是半定量分析，以Ip、Igg組相對(duì)表達(dá)差異倍數(shù)來判斷是否有結(jié)合作用。
4. RIP說明書說的5ug抗體是怎么計(jì)算的？
抗體說明書中有質(zhì)量濃度的話可以進(jìn)行換算。如無，可按說明書中建議的體積量使用。
5. 在RIP實(shí)驗(yàn)中，IP和WB使用的抗體需要來源于不同的種屬嗎？
在RIP實(shí)驗(yàn)中，IP和WB使用的抗體最好來源于不同的種屬，否則在跑WB時(shí)，會(huì)在55KD和25KD的位置出現(xiàn)較強(qiáng)的重鏈和輕鏈，影響目的蛋白的曝光。
詳細(xì)內(nèi)容可參考：
如何避免IP檢測過程中的重鏈干擾與輕鏈干擾_中國生物器材網(wǎng) (bio-equip.com)
如何避免免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)中的igG交叉污染 - 百度文庫 (baidu.com)
6. RIP中蛋白提取步驟中用到的丙酮有替代品嗎?
丙酮適用本試劑盒說明書中的實(shí)驗(yàn)操作。客戶也可用其它方法進(jìn)行蛋白沉淀提取。
7. BufferE加入β-巰基乙醇后出現(xiàn)白色絮狀沉淀，正常嗎？
正常。室溫平衡一會(huì)即可，即使仍有白色沉淀也不影響使用。
8. RIP結(jié)果WB檢測正常，IP、Igg兩組ct值幾乎無差異說明什么？
說明目的蛋白與目標(biāo)基因無特異性結(jié)合。
9. RIP試劑盒適用于裂解細(xì)菌嗎？
細(xì)菌樣本用液氮速凍研磨后，再進(jìn)行這些裂解步驟即可。
10. MeRIP和RIP技術(shù)或試劑盒可以通用嗎？
MeRIP和RIP，雖然核心原理一樣，但兩個(gè)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法、流程、所用抗體以及應(yīng)用都是不一樣的，不能通用。
了解更多：
https://mp.weixin.qq.com/s/S84RXllkC0CegN61EZ84hA
https://mp.weixin.qq.com/s/520lOrEJrqZV7XutP4KE_Q
