RIP技術就好比釣魚，抗體是魚餌，目的蛋白-RNA復合物就是大魚，想要釣到大魚，裝備和技術都很重要！

什么是RIP？

RNA Immunoprecipitation（RIP）是研究細胞內RNA與蛋白結合的技術，是了解轉錄后調控網絡動態過程的有力工具。RIP利用特異性抗體對目標蛋白進行捕獲，實現目標蛋白-RNA復合物的富集，再通過對復合物中蛋白和RNA的檢測和分析，探索分子間相互結合關系。

分離復合物中的RNA，可通過qRT-PCR或高通量分析技術（高通量測序、基因芯片）對其定性及定量分析；分離復合物中的蛋白，通過WB或質譜等方法，可用于做質控、檢測目標蛋白抗體質量以及研究與目標蛋白結合的其他互作蛋白。

“釣魚佬” 怎么做RIP？

真的跟釣魚很像

老練“釣魚佬”聊聊RIP實驗如何優化？

#1選對合適的魚餌（抗體）

鯉魚愛吃玉米，青魚愛吃螺絲，要釣到想吃的大魚，需要根據魚的習性選擇魚餌。

RIP實驗是以RNA結合蛋白（RBPs）出發，研究與目的RBPs互作的RNA或蛋白，因此選擇的抗體必須具有較強的特異性且結合能力，才能高效準確拉取需研究的RNA-蛋白復合物。

使用IP級抗體

市面上有針對WB、IHC/IF、IP等不同實驗的抗體：WB抗體一般選用人工合成多肽作為抗原制備，識別蛋白質的線性抗原表位；IHC/IF抗體識別的是未經加熱變性處理的抗原表位，屬于構象型或線性，一般用重組蛋白作為抗原制備，也可是人工合成多肽作為抗原制備；IP實驗需要識別自然狀態下的蛋白，因此最好選擇天然蛋白作為抗原制備的抗體，也可選擇由重組蛋白抗原制備的抗體。而人工合成多肽作為抗原制備的抗體，可能由于識別位點包裹在蛋白質內部無法識別，因此IP實驗最好不要選擇這種抗體。

多克隆抗體vs單克隆抗體

多克隆抗體能結合靶蛋白的多個不同表位，為異質性抗體混合物，即同一靶蛋白可能結合多個抗體，因此多克隆抗體具有很高的親和性。在RIP實驗中使用多克隆抗體，能更容易拉取目的蛋白，有利于獲得更好的結果。

單克隆抗體只檢測每個抗原上的一個表位，不易與其它蛋白質發生交叉反應，因此具有很高的特異性，在定量實驗中產生的背景信號更少。單克隆抗體能提高實驗重現性，且能高效結合目的抗原。但與多克隆抗體相比，單克隆抗體更容易受化學處理造成的抗原表位丟失的影響。

多克隆抗體和單克隆各有優缺點，可根據自身實驗需求及目的蛋白的情況選擇合適的類型。

#2選好性價比高的魚竿（試劑盒）

RIP實驗涉及的緩沖液試劑較多，一般使用試劑盒進行RIP實驗，國內外有眾多RIP試劑盒產品，但試劑盒和魚竿一樣，不需要選擇最貴的。

吉賽生物的RIP試劑盒（PureBinding?RNA Immunoprecipitation Kit）獲得了眾多“釣魚佬”青睞，還能提供及時且專業的“垂釣咨詢”！

#3適當調整釣魚技巧（實驗步驟）

樣本準備

實驗中需要使用無RNase的吸頭及離心管，盡量降低環境中RNase對實驗的影響；細胞裂解時，應溫和，防止核酸析出聚集成團；如果裂解不充分，可以適當增加裂解時間，但不宜過長，因為會使RNA降解；如果后續需進行高通量測序，則細胞樣本必須先排除支原體污染。收集樣本后，可先做目的蛋白的預檢，即裂解細胞后，取部分細胞裂解液用IP抗體進行WB實驗，檢測裂解液中蛋白的含量及抗體的質量，從而調整樣本的用量及抗體的使用。釣魚也得選好水域，水庫和魚塘都可以，但污水溝里是釣不到好魚的。

捕獲抗原

RIP實驗一般是先把抗體鏈接到磁珠，再與裂解液中抗體孵育，因此抗原抗體孵育步驟需要在垂直混勻器中進行，避免磁珠沉底結塊。孵育時間需適當（2h~過夜），時間太短可能導致抗原抗體結合不充分，時間太長則可能導致背景增加或者RNA降解。具體孵育時間可根據實驗樣本或者預實驗情況而定。

孵育后洗滌

多次洗滌或者更劇烈的洗滌，對改善背景有一定的幫助，但也有可能破壞目標復合物之間的互作。

RNA提取

免疫沉淀得到的RNA，量一般很少，一般采用微量RNA提取方法。

吉賽生物RIP試劑盒（PureBinding?RNA Immunoprecipitation Kit）配備柱式提取RNA相關試劑，更省心更高效更高質。產量RNA量較少，會導致RNA純度和濃度測量不準確，可通過RT-qPCR或高通量測序檢測分析。

#4吃魚肉還是喝魚湯？（準確分析結果）

大魚釣上來了，那不得好好做頓魚宴和家人們分（xuan）享（yao）啊！同樣，得到RIP產物之后，可根據不同需求進行分析，讓文章大放光彩。

可取RIP洗脫產物進行WB檢測，根據結果分析目的蛋白豐度、富集效率、抗體質量等，可依據WB結果對實驗條件或操作進行相應調整。

若需要尋找RBP互作的RNA，想研究RBP結合的RNA有哪些類型，可以進行高通量測序，從而對比Input組分析IP組中RBP互作RNA類型。

若有預測的互作RNA，或驗證RIP-seq結果中的某種RNA，則可以通過RT-qPCR檢測具體的互作RNA。結果一般用Input組目標基因CT值作為參照，IgG陰性對照組和IP組目的基因的相對表達量分別作柱狀圖（如下圖），IgG陰性對照組和IP組目的基因相對表達量有統計學意義則認為目的RBPs和RNA有結合。

圖引用自發表于期刊Molecular Cancer的文章“The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC”，該研究使用吉賽生物RIP試劑盒（PureBinding?RNA Immunoprecipitation Kit），anti-FUBP1或anti-IgG抗體對MCF-7細胞裂解液進行RIP檢測，然后用RT-PCR和qRT-PCR檢測circACTN4的富集程度。

有人說生物實驗是一門玄學，但是RIP實驗和釣魚一樣，成功都是有跡可循。準備優質的試劑和樣本，保持良好的心態，注意實驗步驟細節，取得好的實驗結果，發高分文章便指日可待。釣魚可以找外援，RIP技術服務也可以找吉賽生物，吉賽生物可提供細胞培養——RIP實驗——高通量測序/RT-qPCR/質譜分析/WB——結果分析一條龍服務！可隨時聯系小吉探討技術，小吉摸著魚在線等……