circRNA應用新研究正在不斷推出，有利用circRNA表達NGF治療視網膜神經退行性疾病[1]，表達VEGF-A治療糖尿病足潰瘍[2]，表達CAR蛋白或腫瘤抗原治療腫瘤[3-4]，表達猴痘病毒抗原預防猴痘病毒[5]，表達Cas13蛋白抵抗RNA病毒[6]，circRNA作為適配體治療銀屑病[7]……有點讓人目不暇接了，可見circRNA已由一顆生物醫藥研究屆的新星升為炙熱之星！

技術革新開拓科研思路，技術瓶頸突破推動研究發展。各大科研團隊對circRNA體外制備的策略創新，為推進環狀RNA的成藥作出貢獻。但超長和超短序列的circRNA的合成似乎仍個難點，這極大限制了circRNA的應用范圍。

比如近年來，利用mRNA表達Cas 9蛋白發揮CRISPR系統功能的研究陸續有報道，mRNA的不穩定性仍然是該應用推廣主要的限制因素；然而，利用circRNA表達Cas 9蛋白仍鮮有報道，可能就是由于Cas 9蛋白分子量較大，其對應超長circRNA合成和LNP包封難度較大。

那么超長、超短序列的circRNA合成究竟有多難？！

01超長circRNA序列合成難點

① 高質量模板是IVT RNA的關鍵，而序列越長，質粒構建過程發生突變的概率越高，出現的突變位點越多，修復起來也非易事。② 隨著IVT circRNA長度的增加，線性前體RNA兩端形成雙鏈RNA(dsRNA)和二級結構的可能性也增加，顯著降低了末端連接的效率。③ 添加寡核苷酸輔助夾板可防止線性前體RNA末端二級結構的形成，但夾板片段的引入增加了目標產物純化和回收的難度。④ 線性前體RNA的環化是熵變不利的過程，而序列越長，熵變會越不利，反應效率會變得更低。⑤ 當增加線性前體RNA濃度以提高反應效率，會增加分子間連接的副反應，嚴重影響目標產物的產量。

02超短circRNA序列合成難點

① 超短序列產生的彎曲應力更高，使分子間連接產生多聚體的副反應比分子內環化反應更容易發生，最終導致目標產物產量下降。

② 為減少副反應使反應物濃度下降，則會導致反應效率下降。③ 針對夾板法環化而言，需要設計更短的夾板，但仍解決不了分子間連接產生多聚體的副反應問題。

然而，超長、超短序列circRNA可大有用途！

01超長序列

① 表達CRISPR系統的Cas蛋白，特別是常用但分子量較大的Cas9蛋白。超長序列circRNA的穩定、高質量合成可推進circRNA在CRISPR系統的應用。② 表達其它分子量較大的蛋白，如融合蛋白，以及研究熱點的雙靶CAR實現基于circRNA的雙靶CAR-T治療。

相關研究1

Su等（2024）利用circRNA表達添加靶向ER修飾的Cas13顯示出優越的抵抗RNA病毒的活性。[6]

考慮到黃病毒RNA可以復制并隱藏在ER相關膜結構中，研究團隊通過circRNA表達修飾的Cas13以靶向ER (erCas13)。單獨遞送erCas13 circRNA顯示出基礎抗病毒活性，未遞送RNA組的GFP(+)率達到~81%時，erCas13 circRNA將病毒感染抑制至GFP(+)率低約63%。添加sgRNA, erCas13 circRNA可以進一步抑制感染，將病毒感染降低至~45% GFP(+)。轉染erCas13 線性mRNA或circRNA后，都持續出現一定水平的抗病毒活性。然而，與mRNA相比，erCas13 circRNA可以翻譯更多的erCas13，以幫助sgRNA獲得更好的抗病毒活性。

圖1 f：環狀RNA編碼ER靶向Cas13的設計示意圖。g：N18細胞共轉染DNA編碼erGFP的質粒和編碼flag標記Cas13或erCas13的circRNA。h-j：用mRNA或circRNA形式的erCas13 RNA處理N18細胞，并感染JEV-GFP，然后按特定的時間和劑量加入sgRNA。i：RNA電泳顯示使用的mRNA和circRNA。j：48 h (erCas13 RNA轉染66 h)流式細胞術分析N18細胞。

02超短序列

① 作為CRISPR系統的gRNA、crRNA，發揮更穩定、更持久、更安全的功能；② 發揮短序列核酸適配體的功能；③ 作為短序列天然RNA表達，研究其功能機制，或在體內發揮相應的功能；④ 作為其它超短序列RNA發揮作用。

相關研究2

Wu等（2023）將核酸酶激活的CRISPR- Cas12a與環狀CRISPR RNA用于生物傳感。[8]環狀結構的CRISPR RNA (crRNA)抑制Cas12a對位點特異性雙鏈DNA切割和非特異性單鏈DNA反式切割。具有RNA切割活性的核酸酶(NAzymes)可以使環狀crRNA線性化，從而激活CRISPR-Cas12a功能。研究利用配體響應核酶和DNAzymes作為分子識別元件，證明了環狀crRNA靶向線性化為生物傳感提供了極大的多功能性。這種策略被稱為“NAzyme-Activated CRISPR- cas12a with Circular CRISPR RNA (NA3C)”。研究使用NA3C對尿路感染進行臨床評估，檢測40例患者尿液樣本中大腸桿菌反應性RNA切割DNAzyme，診斷靈敏度為100%，特異性為90%。

圖2 NA3C用于ATP和大腸桿菌檢測。

相關研究3

Liang等（2024）把多個crRNA置于circRNA中，開發基于Cas12a的引導編輯器，可有效同時編輯多個基因。[9]研究將靶向不同位點的多個crRNA，以及靶向多個位點的RTT-PBS序列串聯在circRNA中。實驗結果表明，該設計可實現雙基因、三基因甚至四基因的高效引導編輯。進一步驗證結果表明CPE具有優良的特異性，幾乎沒有檢測到脫靶效應。低脫靶效應、高編輯效率的CPE系統為利用各種核酸酶開發為新型引導編輯系統提供了范例，多類型的CPE系統在生物研究、疾病治療和作物育種等多場景中將發揮巨大的潛力。

圖3 不同形式CRISPR-Cas12a 編輯器示意圖。

相關研究4

Guo等（2024）利用環狀RNA適配體治療銀屑病小鼠模型。[7]RNA適體是一種新的治療方式，但受到其易降解和免疫原性的限制。研究團隊在前期工作中，證明了短雙鏈環狀RNA (ds-cRNAs)具有極小的免疫原性，且靶向dsRNA活化的蛋白激酶R (PKR)。研究發現通過脂質納米顆粒將ds-cRNA遞送到脾臟會減弱所檢測的脾細胞中的PKR活性，導致表皮厚度減少。研究表明環狀RNA作為適配體，可以減輕PKR的過度激活，達到治療目的，代表了一種有前景的療法。

圖4 EPIC（適配體）與PKR蛋白在動力學上的高親和力。

那怎么辦？不要慌！

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Qsep檢測超短（上）、超長（下）轉錄環化產物

Qsep檢測超短（上）、超長（下）純化后circRNA完整性＞90%

參考文獻

[1] Jiang W, et al. Circular RNA-based therapy provides sustained and robust neuroprotection for retinal ganglion cells. Mol Ther Nucleic Acids. 2024, 35(3):102258.

[2] Liu J, et al. A single dose of VEGF-A circular RNA sustains in situ long-term expression of protein to accelerate diabetic wound healing. J Control Release. 2024, 373:319-335.[3] Zhang X, et al. Scarless circular mRNA-based CAR-T cell therapy elicits superior anti-tumor efficacy. bioRxiv. 2024.[4] Wang F, et al. Circular RNA-based neoantigen vaccine for hepatocellular carcinoma immunotherapy. MedComm (2020). 2024, 5(8):e667.[5] Zhou J, et al. Circular RNA vaccines against monkeypox virus provide potent protection against vaccinia virus infection in mice. Mol Ther. 2024, 32(6):1779-1789.[6] Su CI, et al. A cis-acting ligase ribozyme generates circular RNA in vitro for ectopic protein functioning. Nat Commun. 2024, 15(1):6607.[7] Guo SK, et al. Therapeutic application of circular RNA aptamers in a mouse model of psoriasis. Nat Biotechnol. 2024. doi: 10.1038/s41587-024-02204-4.[8] Wu Y,  et al. Nucleic Acid Enzyme-Activated CRISPR-Cas12a With Circular CRISPR RNA for Biosensing. Small. 2023, 19(41):e2303007.[9] Liang R, et al. Prime editing using CRISPR-Cas12a and circular RNAs in human cells. Nat Biotechnol. 2024 . doi: 10.1038/s41587-023-02095-x.