根據(jù)中心法則，DNA是遺傳信息的載體，蛋白質(zhì)是生物活動(dòng)的主要執(zhí)行者。蛋白表達(dá)豐度受RNA合成（轉(zhuǎn)錄）、RNA降解（轉(zhuǎn)錄后）、蛋白質(zhì)合成（翻譯）和降解（翻譯后）等多個(gè)過(guò)程的影響。

RNA翻譯蛋白過(guò)程連接轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組，極消耗能量，因而受?chē)?yán)密的調(diào)控，以節(jié)省細(xì)胞資源，并避免毒性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。

翻譯速率可決定蛋白質(zhì)的折疊構(gòu)象、定位與功能、產(chǎn)量及對(duì)應(yīng)的細(xì)胞表型。蛋白質(zhì)合成(翻譯)速率與最終蛋白質(zhì)豐度的相關(guān)性較高，翻譯速率對(duì)蛋白質(zhì)水平的貢獻(xiàn)最大。因此，翻譯組研究是分析基因表達(dá)和調(diào)控水平的重要環(huán)節(jié)。

更重要的是，近年來(lái)陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，曾被認(rèn)為非編碼的RNA（ncRNA）可編碼或翻譯蛋白，而翻譯組分析可精準(zhǔn)可視化研究編碼全新隱秘多肽的ncRNA（如circRNA、lncRNA）。

01丨多聚核糖體圖譜分析（Polysome profiling）

——傳統(tǒng)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”

Polysome profiling技術(shù)是基于蔗糖濃度梯度溶液超離心，將細(xì)胞質(zhì)RNA分離成多個(gè)組分：游離RNA，結(jié)合核糖體40S或60 S亞基、單核糖體(80S)或多聚核糖體等。一條翻譯的mRNA可同時(shí)結(jié)合多個(gè)核糖體，結(jié)合核糖體組分的RNA與總胞質(zhì)RNA的比例可以間接反映翻譯水平。

丨Polysome profiling步驟

①裂解細(xì)胞：添加翻譯延伸抑制劑，在增殖階段裂解細(xì)胞，分離細(xì)胞質(zhì)裂解液；

②超速離心：把裂解液轉(zhuǎn)移到梯度蔗糖溶液后，超速離心將RNA分離成不同的組分；

③收集組分：利用密度梯度分餾系統(tǒng)，UV吸光度檢測(cè)核酸濃度并收集各個(gè)組分；

④回收產(chǎn)物：從蔗糖溶液組分中回收RNA復(fù)合物；

⑤分析產(chǎn)物：繪制核糖體圖譜；RT-qPCR分析特定RNA；高通量測(cè)序分析全局RNA概況；Western Blot或質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)。

圖1 Polysome Profiling技術(shù)路線圖。（source：Su D, et al., 2024）

丨Polysome profiling技術(shù)優(yōu)勢(shì)

① 直觀反映細(xì)胞和組織內(nèi)的翻譯狀態(tài)；

② 對(duì)胞質(zhì)RNA翻譯水平分級(jí)，可針對(duì)感興趣組分進(jìn)一步分析不同的翻譯機(jī)制；

③ 結(jié)合高通量測(cè)序可全面、精準(zhǔn)、高通量反映翻譯組概況。

Polysome profiling技術(shù)局限

① 需專(zhuān)門(mén)設(shè)備在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室可能無(wú)法獲得；

② 操作較繁瑣：需一系列繁瑣的溶液配置、離心、分離、檢測(cè)等操作步驟，耗時(shí)長(zhǎng)且對(duì)操作者要求較高；

③ 容易受干擾：細(xì)胞內(nèi)普遍存在高分子量的復(fù)合物，容易對(duì)多聚核糖體收集和檢測(cè)造成干擾。

02丨核糖體印跡測(cè)序（Ribo-seq）

——更詳細(xì)地分析翻譯的強(qiáng)大工具

Ribo-seq可獲得核糖體沿著翻譯mRNA的精確位置，從而得到詳細(xì)翻譯事件的直接證據(jù)，可在密碼子分辨率上進(jìn)行全翻譯組檢測(cè)。

丨Ribo-seq步驟

① 使用延長(zhǎng)抑制劑阻止核糖體移位，然后收取細(xì)胞;

② 用RNase消化細(xì)胞裂解物，裸露的RNA片段打斷，而核糖體保護(hù)RNA片段得以保留；

③ 去除干擾的rRNA，去除核糖體，收集核糖體保護(hù)片段(RPF)，也稱(chēng)為核糖體足跡;

④ 建庫(kù)，針對(duì)RPF深度測(cè)序并分析獲取的核糖體足跡數(shù)據(jù)。

丨Ribo-seq技術(shù)優(yōu)勢(shì)

① 提供精確而豐富的核糖體位置信息，可更詳細(xì)分析翻譯調(diào)控事件，包括翻譯起始、延伸、停止和終止或非常規(guī)的翻譯事件，如非AUG介導(dǎo)的翻譯起始、停止密碼子讀取、以及翻譯新的小開(kāi)放閱讀框(sORF)，或以前被認(rèn)為是非編碼RNA (ncRNAs)的非典型可翻譯RNA；

② 可瞬時(shí)捕獲翻譯過(guò)程的狀態(tài)，定量分析翻譯效率，對(duì)研究翻譯調(diào)控動(dòng)態(tài)變化具有重要意義；

③ Ribo-seq可同時(shí)捕獲大量基因的翻譯活動(dòng)，為構(gòu)建全局性翻譯提供可能，結(jié)合RNA-seq，可系統(tǒng)研究基因表達(dá)與翻譯調(diào)控之間的關(guān)系。

丨Ribo-seq技術(shù)局限

① 細(xì)胞中不同的mRNA的核糖體延伸率不同，無(wú)法區(qū)分翻譯活躍的核糖體和停滯狀態(tài)的核糖體，可能導(dǎo)致翻譯效率的偏差；

② 小RNA片段(如調(diào)控性非編碼RNA)的污染可能導(dǎo)致翻譯組數(shù)據(jù)的誤解；

③ 核糖體的構(gòu)象、不適當(dāng)?shù)暮怂崦该盖泻吞囟ǖ腞NA二級(jí)結(jié)構(gòu)，都可能影響足跡長(zhǎng)度。

03丨核糖體-新生體-鏈復(fù)合體測(cè)序（RNC-seq）

——全長(zhǎng)翻譯mRNA測(cè)序

RNC-seq技術(shù)分離出核糖體結(jié)合RNA進(jìn)行高通量測(cè)序，不經(jīng)過(guò)RNase處理，保留RNA全長(zhǎng)信息。

丨RNC-seq技術(shù)優(yōu)勢(shì)

① 實(shí)驗(yàn)操作較簡(jiǎn)便；

② 較長(zhǎng)的片段建庫(kù)，排除了潛在的污染物(如調(diào)控性小RNA)；

③ 長(zhǎng)片段更可能跨越mRNA和circRNA的剪接位點(diǎn)，檢測(cè)更多的選擇性剪接(AS)異構(gòu)體或翻譯circRNA；

④ 與RNA-seq結(jié)合使用，可通過(guò)計(jì)算翻譯比率，評(píng)估哪些mRNA剪接變體在全基因組范圍內(nèi)翻譯。

丨RNC-seq技術(shù)局限

①RNC RNA易降解；

②一個(gè)或多個(gè)核糖體結(jié)合的翻譯RNA分子被統(tǒng)一分析，而不是像polysome Profiling分成多個(gè)組分進(jìn)行分析，翻譯效率分析準(zhǔn)確性較低；

③若無(wú)合適計(jì)算分析，RNC-seq由于丟失了翻譯RNA上核糖體的位置信息，而無(wú)法精確定義非常規(guī)ORF的位置，只能為非規(guī)范ORF的翻譯提供間接證據(jù)。

04丨雙核糖體測(cè)序（Disome-seq）

——翻譯調(diào)控研究新技術(shù)

停滯的核糖體(stalled ribosomes)是指在翻譯過(guò)程中暫時(shí)停止或顯著放慢移動(dòng)的核糖體。核糖體停滯可能由于多種原因，包括罕見(jiàn)密碼子的存在、mRNA的超二級(jí)結(jié)構(gòu)、損壞的mRNA或特定的結(jié)合蛋白質(zhì)的存在，直接導(dǎo)致異常蛋白的合成或核糖體的缺乏，從而調(diào)控翻譯。核糖體碰撞形成的串聯(lián)雙核糖體，可介導(dǎo)共翻譯事件，對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用。

Disome-seq是基于Ribo-seq發(fā)展的技術(shù)，通過(guò)分離核糖體-RNA復(fù)合物，用RNase進(jìn)行酶切消化，裸露的RNA被酶切，而核糖體保護(hù)的RNA得以保留。然后分離純化得到雙核糖體保護(hù)的RNA片段，進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。

Disome-seq具有Ribo-seq技術(shù)的優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，可針對(duì)雙核糖體碰撞發(fā)生的RNA進(jìn)行分析，有利于研究共翻譯等特殊翻譯調(diào)控機(jī)制。

丨Disome-seq技術(shù)優(yōu)勢(shì)

①揭示全局RNA中碰撞雙核糖體的足跡；

②針對(duì)性研究翻譯停滯、共翻譯等特殊的翻譯調(diào)控事件。

丨Disome-seq技術(shù)局限

① 僅針對(duì)性分析串聯(lián)雙核糖體結(jié)合的RNA；

② 對(duì)樣品處理和分析的要求較高，可通過(guò)增加核糖體圖譜分析環(huán)節(jié)，通過(guò)檢測(cè)雙核糖體的特征峰，篩選合格樣本進(jìn)入下游分析流程，有效保障建庫(kù)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量。

Polysome profiling可以準(zhǔn)確研究翻譯效率，研究翻譯調(diào)控、翻譯活性等；

Ribo-seq可以研究RNA的翻譯機(jī)制、翻譯起始和終止位點(diǎn)及ORF等；

RNC-seq可以研究翻譯復(fù)合物的組成和活性，以及挖掘潛在可翻譯的非典型RNA；

Disome-seq可以分析雙核糖體或核糖體碰撞事件研究特定的翻譯調(diào)控機(jī)制。

其中，Ribo-seq和RNC-seq實(shí)際上是從兩個(gè)不同的方面評(píng)估RNA翻譯，兩者不能相互替代。

吉賽翻譯組技術(shù)服務(wù)內(nèi)容

吉賽生物可提供Ploysome profiling、Ribo-seq和RNC-seq一系列經(jīng)典翻譯組研究技術(shù)服務(wù)，還可提供Polysome-seq和Disome-seq，可根據(jù)個(gè)性化需求選取不同、單/多個(gè)分離組分進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。翻譯組研究無(wú)煩惱！

                                                                   Polysome Profiling圖譜示例

特點(diǎn)	Polysome profiling/ Polysome-seq	Ribo-seq	RNC-seq	Disome-seq
mRNA長(zhǎng)度	全長(zhǎng)	核糖體保護(hù)片段區(qū)域	全長(zhǎng)	雙核糖體保護(hù)片段區(qū)域
翻譯中RNA回收難度	難	難	易	難
起始量	多	多	少	多
測(cè)序方法	Microarray/NGS	NGS	Microarray/NGS	NGS
測(cè)序長(zhǎng)度	任意	22-35 nt	任意	約54-68 nt
檢測(cè)序列變異	√	×	√	×
UTR	√	×	√	×
檢測(cè)核糖體位置、密度、ORF、uORF	×	√	×	√
每條mRNA上核糖體數(shù)目	√	×	×	×
技術(shù)難點(diǎn)	離心，梯度液分離，RNA 回收	酶切條件	RNC-mRNA 易斷裂	酶切條件
生理?xiàng)l件	√	√	√	√
吉賽服務(wù)項(xiàng)目	圖譜（5或18組分）	Ribo-seq測(cè)序分析	RNC-seq測(cè)序分析	無(wú)圖譜-Disome-seq測(cè)序分析
	圖譜+RNA（5或18組分）
	圖譜+qPCR（5或18組分）
	圖譜+WB（5或18組分）			圖譜+Disome-seq測(cè)序分析
	圖譜+測(cè)序（組分⑤單文庫(kù)）
	圖譜+測(cè)序（雙文庫(kù)-Light+Heavy組分）
	圖譜+測(cè)序（雙文庫(kù)-Free+Binding組分）